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原位杂交试验

收集斑马鱼的胚胎,在holfretor水中培养,到达所需要的发育时期时,用蛋白酶去除卵膜,用4%-固定,在4℃保存,二十四小时后用50%甲6醇2%-溶液洗,然后换成甲9醇,在-20c 保存,待用(两天和两天以上的胚胎需要用双氧6水处理,去除色素。或者使用-锍脲稀溶液培养,可阻断色素的形成)





就dna探针和rna探针的比较,dna探针在杂交过程中会出现探针双链之间退火的可能,也更倾向于在溶液中形成大分子的探针聚合体,从而影响其渗透能力。而rna 探针的应用,将提高dna-rna杂交子的热稳定性。

tips:rna探针因其单链、高分子结合力、可适应高温杂交的特性,其检测特-和灵敏度均优于dna探针。常用的rna探针标记方法为构建质粒后进行转率合成。通过pcr扩增的方法,可以更方便地进行rna探针的制备;rna探针合成后,还需验证其对目标片段检测的灵敏度和特-。





根据不同的杂交实验要求,应选择不同的-探针。在大多数情况下,可以选择克0隆的dna或cdna双链探针。但是在有些情况下,必须选用其它类型的探针如寡核苷酸探针和rna探针。例如,在检测靶序列上的单个碱基改变时应选用寡核苷酸探针,在检测单链靶序列时应选用与其互补的dna单链探针通过克0隆人m13噬菌体dna获得或rna探针,寡核苷酸探针也可。长的双链dna探针特-较强,适宜检测复杂的靶核苷酸序列和病原体 ,但不适宜于组织原位杂交,因为它不易透过细胞膜进入胞内或核内。在这种情况下,寡核苷酸探针和短的pcr标记探针80~150bp具有较大的-性。





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